中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)與健康工程研究所研發(fā)世界首款短波長激發(fā)時間與光譜分辨新型雙光子顯微鏡，該顯微鏡創(chuàng)新性地采用中心波長為520 nm的鎖模飛秒光纖激光器作為雙光子激發(fā)光源，可以有效地激發(fā)短波長波段熒光團，利用連接光譜儀的時間相關(guān)單光子計數(shù)(TCSPC)模塊，可以實現(xiàn)熒光光譜和熒光壽命的同時檢測。該技術(shù)可以實現(xiàn)紫外波段自體熒光的有效激發(fā)與探測，極大地拓展了雙光子成像技術(shù)的應(yīng)用范圍，為無創(chuàng)觀測生物樣品及生命過程提供了一種新的研究工具。
在生物體中，普遍存在著內(nèi)在的一些生物分子具有內(nèi)源性熒光團，內(nèi)源性熒光團的三維成像可以在不干擾生物環(huán)境的情況下對重要生物過程進行無創(chuàng)體內(nèi)檢查，如代謝變化、形態(tài)改變和疾病進展，是組織成像和跟蹤細胞代謝過程的有力工具。另一方面，雙光子顯微鏡具有天然的光學(xué)切片能力，即無需物理切割就可以實現(xiàn)生物組織的三維高分辨成像。雙光子顯微鏡跟內(nèi)源性熒光團的結(jié)合可以實現(xiàn)活體生物組織無標(biāo)記成像，對很多生命活動的研究具有非常重要的意義。遺憾的是，傳統(tǒng)雙光子顯微鏡都是用鈦寶石激光器作為光源，只能對可見光波段的內(nèi)源性熒光團進行探測，對于信息更豐富的短波長熒光團則無能為力。
中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院鄭煒研究員團隊首創(chuàng)采用520nm超快激發(fā)源搭建光譜分辨的雙光子熒光壽命成像系統(tǒng)，可以有效激發(fā)和探測傳統(tǒng)雙光子顯微系統(tǒng)無法成像的一系列短波長熒光團，比如作為細胞內(nèi)代謝相關(guān)酶和蛋白質(zhì)基本組成部分的色氨酸（單光子吸收峰~280 nm），作為血液主要成分的血紅蛋白(雙光子最佳激發(fā)波長<600 nm)，作為人體重要神經(jīng)遞質(zhì)的血清素(單光子吸收峰~280 nm)等等。為了探索該系統(tǒng)的實用性，研究團隊首先系統(tǒng)地評估了生物組織中典型的短波內(nèi)源性熒光團純化學(xué)樣品在520nm激發(fā)下的熒光壽命和光譜特性，包括熒光分子酪氨酸、色氨酸、血清素(5-HT)、煙酸(維生素B3 (VB3))、吡哆醇(維生素B6 (VB6))和NADH，以及角蛋白、彈性蛋白和血紅蛋白。
隨后，研究團隊對不同的生物組織進行了成像，包括離體大鼠食管組織和離體大鼠口腔面頰組織。結(jié)果表明，該系統(tǒng)可以在不需要任何外加造影劑的情況下為生物系統(tǒng)提供高分辨率的三維形態(tài)信息和物理化學(xué)信息。該研究工作探索了短波長的內(nèi)源性熒光團在食管壁中的分布。研究結(jié)果表明，該系統(tǒng)可以很清晰的看到食管的不同分層結(jié)構(gòu)：上皮細胞（KE、SE）、固有層(LP)、粘膜層(SM)、外縱肌(MP)、纖維膜(FB)。而食管癌主要就發(fā)生在食管內(nèi)部上皮細胞、固有層和粘膜層這些地方。結(jié)合壽命和光譜信息，系統(tǒng)可以明確識別食管內(nèi)部多層結(jié)構(gòu)的不同信號來源，定量區(qū)分不同組織成分在食管壁的位置和數(shù)量，區(qū)分食管分層結(jié)構(gòu)。
最后，研究團隊進一下對小鼠皮膚進行了活體三維掃描成像，并基于短波內(nèi)源熒光團在體內(nèi)捕獲了小鼠耳廓內(nèi)白細胞的遷移，實現(xiàn)了典型免疫反應(yīng)(脂多糖注射或機械創(chuàng)傷)微環(huán)境中白細胞募集和變形運動的動力學(xué)過程可視化以及隨時間的熒光壽命測量。熒光強度圖像可以顯示亞細胞結(jié)構(gòu)，色氨酸和血紅蛋白的熒光壽命信息可以區(qū)分紅細胞和白細胞，以及傷口和正常組織的位置。這些結(jié)果進一步驗證了該研究工作開發(fā)的系統(tǒng)在天然組織環(huán)境中監(jiān)測免疫反應(yīng)的能力。
該工作以題為《Short-wavelength excitation two-photon intravital microscopy of endogenous fluorophores》發(fā)表在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)領(lǐng)域知名期刊Biomedical Optics Express上，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)與健康工程研究所助理研究員吳婷為文章第一作者，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)與健康工程研究所鄭煒研究員、李慧副研究員，北京大學(xué)物理學(xué)院施可彬研究員為共同通訊作者。該工作獲得了國家重點研發(fā)計劃項目，國家自然科學(xué)基金儀器項目、面上項目、培育項目、青年項目，中國科學(xué)院科學(xué)儀器創(chuàng)新團隊項目，深圳市基礎(chǔ)研究計劃等項目的支持。
圖1.生物組織中典型的短波內(nèi)源性熒光團純化學(xué)樣品的熒光壽命和光譜特性
圖2.短波長內(nèi)源性熒光團在食管壁中的三維定量分布
圖3.小鼠皮膚的活體三維無創(chuàng)自體熒光成像：強度圖像(上)，彩色編碼光譜圖像(中)，彩色編碼壽命圖像(下)
圖4 在體、無標(biāo)記、無創(chuàng)地觀察(a)體外注射LPS藥物刺激后小鼠皮膚微循環(huán)變化和(b)針刺損傷后免疫白細胞典型的變形蟲爬行方式及其折疊、變形和相互作用等炎癥反應(yīng)行為
PI與課題組簡介：
鄭煒，研究員，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)與健康工程研究所副所長，生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究中心主任，廣東省生物醫(yī)學(xué)光學(xué)影像技術(shù)重點實驗室主任。國自然優(yōu)秀青年基金獲得者，廣東省特支計劃科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，深圳市杰出青年基金獲得者。
鄭煒研究員及其團隊一直從事雙光子顯微成像技術(shù)研究，帶領(lǐng)團隊研發(fā)了雙光子激發(fā)結(jié)構(gòu)光照明超分辨成像技術(shù)，短波長激發(fā)、熒光壽命和熒光光譜探測的無標(biāo)記雙光子成像技術(shù)，雙光子多幀超分辨成像技術(shù)等多種新型雙光子顯微成像技術(shù)，在成像分辨率、成像深度、成像視野及成像信息豐富程度上都有顯著突破。研究成果發(fā)表在《Nature Methods》、《iScience》、《Photonics Research》、《Optics Letters》等生物光學(xué)領(lǐng)域國際著名期刊上，被包括《Science》、《Nature》、《Nature Methods》、《PNAS》在內(nèi)的期刊引用1400余次。
課題組長期招收新型光學(xué)顯微技術(shù)及儀器研發(fā)、生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)相關(guān)機理研究方向碩士研究生/博士研究生/實習(xí)生/博士后，請感興趣的同學(xué)直接聯(lián)系：zhengwei@siat.ac.cn，簡歷及郵件標(biāo)題注明“應(yīng)聘崗位-學(xué)校名稱-專業(yè)-姓名”。
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