近日，中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室（LMB）研究員王曉雪團(tuán)隊與上海細(xì)胞治療集團(tuán)合作，以細(xì)胞/基因治療臨床需求為導(dǎo)向，開發(fā)了一種利用毒素-抗毒素系統(tǒng)作為克隆篩選標(biāo)記的小骨架質(zhì)粒載體并命名為太質(zhì)粒（Tiniplasmid）。這一毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)應(yīng)用方面的最新成果發(fā)表在在微生物工程應(yīng)用類經(jīng)典期刊Metabolic Engineering上。博士研究生陳喆為論文的第一作者，副研究員姚建云為論文的共同第一以及共同通訊作者，王曉雪為論文的主要通訊作者。
抗生素抗性基因作為最重要的篩選標(biāo)記在DNA克隆，質(zhì)粒發(fā)酵以及預(yù)防菌株污染等方面廣泛應(yīng)用，但由于抗生素使用引發(fā)的安全性問題，抗性基因在食品與藥品等領(lǐng)域的使用受到嚴(yán)格限制，尤其是在基因治療和DNA疫苗研發(fā)方面。鑒于上述原因，研發(fā)高效且安全的篩選系統(tǒng)來取代抗性基因的使用在臨床研究中顯得尤為重要。TA系統(tǒng)由具有明顯細(xì)菌毒性的毒素以及能夠拮抗其毒性的抗毒素編碼組成，具有開發(fā)成新型篩選系統(tǒng)的應(yīng)用潛力。本研究中，我們將攜帶誘導(dǎo)型啟動子的毒素基因整合到工程菌的基因組上，通過誘導(dǎo)毒素來篩選和生產(chǎn)攜帶抗毒素的重組太質(zhì)粒。通過測定不同家族毒素的殺菌活性來評估其作為篩選標(biāo)記的潛力。研究發(fā)現(xiàn)ParE家族毒素具有明顯的殺菌活性，且其對應(yīng)的抗毒素能夠通過直接的蛋白-蛋白相互作用來拮抗其細(xì)胞毒性，該TA系統(tǒng)與抗生素系統(tǒng)具有相當(dāng)?shù)目寺『Y選效率以及DNA質(zhì)粒得率。
以質(zhì)粒為載體的細(xì)胞基因治療與病毒載體相比，具有安全性、工藝簡單、低成本等優(yōu)勢，但質(zhì)粒骨架的大小對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因效率有很大的影響，縮小質(zhì)粒骨架對于提升轉(zhuǎn)基因效率具有重要意義。綜合毒素殺菌能力以及抗毒素大小的優(yōu)勢，我們選取了珊瑚共生菌來源的TA系統(tǒng)Rs_0636/Rs_0637作為目標(biāo)TA系統(tǒng)，成功研發(fā)了最小骨架小于500bp的無抗太質(zhì)粒系統(tǒng)，在本系統(tǒng)太質(zhì)粒中抗毒素基因僅編碼50個氨基酸（153 bp），太質(zhì)粒比常規(guī)的pUC57質(zhì)粒骨架小1000 bp。在上海細(xì)胞治療集團(tuán)開展的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因測試中，基于該系統(tǒng)開發(fā)的太質(zhì)粒在轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率方面比目前商業(yè)化的載體相比更具優(yōu)勢，且通過安全性評估也表明該系統(tǒng)在基因治療和DNA疫苗的研發(fā)中具有非常好的應(yīng)用潛力。
課題組前期在質(zhì)粒編碼的TA 系統(tǒng)的功能研究方面取得了一系列成果，并實現(xiàn)了相關(guān)專利的轉(zhuǎn)化。
以上研究工作得到了國家自然科學(xué)基金項目、上海市浦江計劃、科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項、國家重點研發(fā)計劃等的資助。
圖1. 利用毒素-抗毒素系統(tǒng)Rs_0636/ Rs_0637作為篩選標(biāo)記在真核轉(zhuǎn)基因表達(dá)中的應(yīng)用
相關(guān)論文信息：Zhe Chen#, Jianyun Yao#*, Pingjing Zhang, Pengxia Wang, Songwei Ni, Tao Liu, Yi Zhao, Kaihao Tang, Yan Sun, Qijun Qian, Xiaoxue Wang* (2023) Minimized antibiotic-free plasmid vector for gene therapy utilizing a new toxin-antitoxin system. Metabolic Engineering. 79, p86-96.
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