JACS | Glut1介導(dǎo)用于靶向蛋白降解的溶酶體嵌合體技術(shù)

靶向蛋白質(zhì)降解技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大潛力，尤其是在治療腫瘤和其他蛋白質(zhì)相關(guān)疾病方面。利用分子膠和PROTAC技術(shù)降解細(xì)胞內(nèi)蛋白的研究處于領(lǐng)先地位，而通過溶酶體途徑降解膜蛋白和胞外蛋白及其它大分子的研究仍處于臨床前階段。可利用靶點(diǎn)的匱乏極大地限制了技術(shù)的進(jìn)步，因此探索新的、潛在有效的溶酶體靶向降解策略至關(guān)重要。

6月20日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院醫(yī)藥所耿晉團(tuán)隊(duì)在Journal of the American Chemical Society上發(fā)表了題為“Lysosome Targeting Chimaeras for Glut1-Facilitated Targeted Protein Degradation”的研究成果。這項(xiàng)工作創(chuàng)新性地利用葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1作為溶酶體靶向受體，設(shè)計(jì)了Glut1促進(jìn)溶酶體降解（GFLD）策略。通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合制備了潛在的Glut1配體，并通過生物正交反應(yīng)合成了抗體-糖寡聚物共軛物，將其作為溶酶體靶向蛋白降解分子，用于治療PD-L1高表達(dá)的三陰性乳腺癌。本研究證明了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體Glut1作為一種溶酶體靶向受體，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著更廣泛應(yīng)用的潛力。

文章上線截圖

鑒于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)采用吡喃糖環(huán)椅構(gòu)型的戊糖和己糖的D-立體異構(gòu)體（如D-葡萄糖、D-半乳糖）具有很強(qiáng)的特異性，研究團(tuán)隊(duì)選擇以D-葡萄糖和D-半乳糖為基礎(chǔ)制備了帶丙烯酰胺的糖單體，并進(jìn)一步通過可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合制備了五種含糖寡聚物。五種寡聚物隨后被作為候選的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1配體進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，包括用Glut1蛋白和五種糖鏈進(jìn)行分子對(duì)接與計(jì)算模擬、結(jié)合親和力測(cè)試，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選出細(xì)胞攝取量高的配體來合成溶酶體靶向嵌合體分子。

圖1. 有潛力的Glut1配體的表征

由于人源三陰性型乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7具有Glut1高表達(dá)的特點(diǎn)，因此本研究以之為細(xì)胞模型開展體外實(shí)驗(yàn)。體外篩選分為三個(gè)部分，先通過細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞對(duì)五種候選配體的攝取情況，結(jié)果表明Gal⁶，Gal⁴Glc²和Glc⁶這三種糖寡聚物的內(nèi)化程度較高，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察上述三種配體與溶酶體的共定位情況，發(fā)現(xiàn)攝取量高的三種糖寡聚物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后與溶酶體的共定位程度也較高。

鑒于這一結(jié)果推測(cè)這三種糖寡聚物的內(nèi)化途徑與溶酶體相關(guān)，因此團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)探究配體的攝取途徑，證明了糖寡聚物在細(xì)胞中的攝取是通過溶酶體途徑且與Glut1相關(guān)。綜合上述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)篩選出了有潛力的Glut1配體Gal⁶，Gal⁴Glc²和Glc⁶進(jìn)行下一步的溶酶體靶向嵌合體分子合成。

圖2. 在MDA-MB-231細(xì)胞系中篩選Glut1配體

研究團(tuán)隊(duì)以MDA-MB-231細(xì)胞系高表達(dá)的免疫檢查點(diǎn)PD-L1為目標(biāo)蛋白，選取內(nèi)化有限的PD-L1抗體Avelumab進(jìn)行Ave-糖寡聚物共軛物分子的合成。通過三個(gè)經(jīng)典的正交反應(yīng)將篩選出的有潛力的Glut1配體Gal⁶、Gal⁴Glc²和Gal⁶分別連接到抗體Avelumab上，得到三種有潛力的溶酶體靶向嵌合體分子。通過CCK8檢測(cè)法評(píng)估了三種Ave-糖寡聚物共軛物分子對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的毒性作用，確保細(xì)胞中PD-L1的減少并非由于Ave-糖綴合物分子的細(xì)胞毒性引起。隨后通過免疫印跡法和免疫熒光檢測(cè)驗(yàn)證了三種Ave-糖綴合物都是有潛力的能適度降解PD-L1的蛋白降解劑，其中Ave-Gal⁶的降解效果最佳。

圖3. Ave-糖寡聚物共軛物的蛋白質(zhì)降解活性具有濃度依賴性

此外，免疫印跡檢測(cè)的結(jié)果顯示PD-L1和Glut1的蛋白表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)具有一致的變化趨勢(shì)，對(duì)此研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為在逆轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的作用下，Glut1有從溶酶體逃逸并返回細(xì)胞膜表面的行為，進(jìn)而引發(fā)PD-L1-Ave-糖寡聚物-Glut1復(fù)合物也被帶回到膜上，導(dǎo)致PD-L1蛋白的降解效果尚有提升空間。

團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探討了Ave-糖綴合物降解 PD-L1蛋白的降解機(jī)制是否與糖寡聚物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞的途徑相關(guān)，免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ave-糖寡聚物共軛物分子降解PD-L1蛋白是通過溶酶體途徑介導(dǎo)，并且揭示了Glut1在此策略中扮演了重要角色，相信葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1將在未來的靶向蛋白降解技術(shù)中得到更廣泛的應(yīng)用。

圖4. Ave-糖寡聚物共軛物靶向蛋白降解效率隨時(shí)間的變化情況及其降解機(jī)制

綜上所述，本研究成功開發(fā)了基于溶酶體靶向嵌合體技術(shù)的蛋白質(zhì)降解劑，為腫瘤治療提供了新的治療思路，并成功驗(yàn)證了葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Glut1是一種適用于蛋白質(zhì)降解技術(shù)的溶酶體靶向受體，創(chuàng)新性地提出了Glut1促進(jìn)溶酶體途徑的蛋白降解（GFLD）策略，用于靶向降解膜蛋白，為蛋白質(zhì)降解技術(shù)的發(fā)展鋪平了道路。目前，很多蛋白結(jié)合力好但內(nèi)化效果欠佳的抗體無法充分發(fā)揮價(jià)值，利用Glut1促進(jìn)溶酶體途徑的蛋白降解策略有望在不久的將來改善這些抗體的內(nèi)化效果，預(yù)計(jì)這將大大推進(jìn)抗體偶聯(lián)藥物的開發(fā)進(jìn)程，拓展抗體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用場(chǎng)景，并提高臨床轉(zhuǎn)化率。

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院耿晉研究員為本文的通訊作者，碩士研究生羅錦妍和高權(quán)博士為文章共同第一作者。該研究獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院國(guó)際合作項(xiàng)目的支持。