2023年11月9日，《Cell》期刊以封面文章的形式在線發(fā)表題為《Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells》（高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴）的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組、孫強(qiáng)研究團(tuán)隊(duì)和中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究組合作完成。該研究在國際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴，并證實(shí)了猴胚胎干細(xì)胞可以高效的貢獻(xiàn)到胚外胎盤組織和生殖細(xì)胞。這對于理解靈長類胚胎干細(xì)胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
胚胎干細(xì)胞是指由著床前囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在體外分離培養(yǎng)而來的多能性細(xì)胞，在模式動(dòng)物構(gòu)建、細(xì)胞治療、器官再生、類器官模型等生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。胚胎干細(xì)胞具有體外無限自我復(fù)制更新、誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)多向分化、胚胎注射形成嵌合體等關(guān)鍵特征，其中胚胎注射形成嵌合體被公認(rèn)為是評估胚胎干細(xì)胞多向分化潛能的金標(biāo)準(zhǔn)。
小鼠胚胎干細(xì)胞注射到囊胚并形成嵌合體的技術(shù)是構(gòu)建遺傳修飾小鼠模型的關(guān)鍵技術(shù)。1984年首次實(shí)現(xiàn)小鼠胚胎干細(xì)胞胚胎注射形成嵌合體，2008年成功實(shí)現(xiàn)大鼠胚胎干細(xì)胞胚胎注射形成嵌合體。建立非人靈長類胚胎干細(xì)胞嵌合體技術(shù)對于生物醫(yī)藥研究具有非常重要的意義，然而非人靈長類胚胎干細(xì)胞嵌合體研究一直進(jìn)展緩慢。
該研究的首要問題在于獲得具有高效發(fā)育潛能的胚胎干細(xì)胞。針對這一問題，研究團(tuán)隊(duì)建立了處于6種不同培養(yǎng)體系下的食蟹猴胚胎干細(xì)胞，進(jìn)而從克隆形態(tài)、免疫熒光、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、線粒體代謝、全基因組甲基化、核型分析和全基因組測序等多方面對處于不同培養(yǎng)條件下食蟹猴胚胎干細(xì)胞進(jìn)行全面系統(tǒng)的評估。發(fā)現(xiàn)5iLAF、4CL和PXGL體系下培養(yǎng)的食蟹猴胚胎干細(xì)胞具有較高的多能性，而且4CL體系下的干細(xì)胞具有更好的傳代穩(wěn)定性和基因組穩(wěn)定性。
胚胎干細(xì)胞注射入受體胚胎后的快速凋亡是影響胚胎干細(xì)胞成功嵌合的關(guān)鍵。研究團(tuán)隊(duì)選用綠色熒光蛋白標(biāo)記的4CL條件下的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行猴胚胎注射實(shí)驗(yàn)，通過測試干細(xì)胞注射入胚胎后的不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)時(shí)間的組合，最終得到了既不影響胚胎正常發(fā)育又能保證干細(xì)胞存活的最優(yōu)嵌合胚胎培養(yǎng)條件。而且5iLAF和Primed體系下的胚胎干細(xì)胞在該優(yōu)化條件下也表現(xiàn)出胚胎注射后的高存活率。將注射了4CL和5iLAF干細(xì)胞的嵌合胚胎分別在體外延遲培養(yǎng)到第17天，發(fā)現(xiàn)注射的胚胎干細(xì)胞仍然可以高效存活，單細(xì)胞測序 表明猴胚胎干細(xì)胞可以與受體胚胎細(xì)胞同步發(fā)育，并且貢獻(xiàn)到第17天猴胚胎的不同細(xì)胞譜系中。
在系統(tǒng)性評估了不同培養(yǎng)條件下猴胚胎干細(xì)胞狀態(tài)和改進(jìn)優(yōu)化了嵌合胚胎培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將注射了綠色熒光標(biāo)記的4CL干細(xì)胞的胚胎移植到代孕母猴。在總共得到的10只出生或流產(chǎn)的仔猴中，有一只出生存活猴和一只流產(chǎn)猴檢測到胚胎干細(xì)胞的嵌合。研究團(tuán)隊(duì)建立了包含PCR擴(kuò)增、微衛(wèi)星親子鑒定、基因組單核苷酸多態(tài)性深度測序、流式細(xì)胞儀檢測、綠色熒光蛋白檢測、免疫熒光檢測的一系列嚴(yán)格的嵌合體分析流程，發(fā)現(xiàn)出生存活猴中胚胎干細(xì)胞的貢獻(xiàn)比例高達(dá)70%左右，流產(chǎn)猴中胚胎干細(xì)胞的貢獻(xiàn)比例約20%。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序也進(jìn)一步表明了注射的胚胎干細(xì)胞可以跟受體胚胎細(xì)胞同步分化到出生個(gè)體猴的各種不同細(xì)胞譜系中。
胎盤組織和生殖細(xì)胞是胚胎發(fā)育和重編程過程中的兩類特殊組織或細(xì)胞。其中胎盤組織是由滋養(yǎng)外胚層發(fā)育而來，而生殖細(xì)胞發(fā)育過程中要經(jīng)歷更加劇烈的表觀重編程。研究團(tuán)隊(duì)在兩只嵌合體猴的胎盤組織中均發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)。考慮到小鼠胚胎干細(xì)胞幾乎不會貢獻(xiàn)到胎盤組織，該結(jié)果說明靈長類胚胎干細(xì)胞可能具有不同于嚙齒類的獨(dú)特的發(fā)育全能性特征。此外兩只嵌合體猴的生殖細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞的高比例貢獻(xiàn)，這對后續(xù)基于該技術(shù)的遺傳修飾模型構(gòu)建至關(guān)重要。
該工作建立了系統(tǒng)評估不同培養(yǎng)條件下猴胚胎干細(xì)胞的多能性狀態(tài)的研究體系，并探索得到有利于胚胎干細(xì)胞存活的胚胎嵌合體的培養(yǎng)條件，顯著提升了胚胎干細(xì)胞注入胚胎后的存活效率，最終得到了出生存活的高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的嵌合體猴，證實(shí)了注入的猴胚胎干細(xì)胞可以高效地貢獻(xiàn)到包括胎盤和生殖細(xì)胞在內(nèi)的各種不同組織和細(xì)胞。該研究對于理解靈長類胚胎干細(xì)胞全能性和發(fā)育潛能具有重要意義，為建立基于猴胚胎干細(xì)胞嵌合體的基因打靶和模型構(gòu)建技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
該研究嚴(yán)格遵守生物倫理規(guī)范，所有實(shí)驗(yàn)均符合國際干細(xì)胞研究學(xué)會的研究指南。劉真研究員、Miguel A. Esteban研究員和孫強(qiáng)研究員為該論文共同通訊作者。博士研究生曹靜、副研究員李文娟、副研究員李杰、副研究員Md. Abdul Mazid、助理實(shí)驗(yàn)師李春楊、博士研究生姜禹、博士研究生賈雯淇為該論文共同第一作者。該研究還得到了腦智卓越中心蒲慕明院士、西北農(nóng)林科技大學(xué)王小龍教授、華大生命科學(xué)研究院徐訊研究員和劉龍奇研究員、劍橋大學(xué)Patrick Maxwell教授以及華大生命科學(xué)研究院多位合作同事的大力支持。該研究獲得了科技部、中國科學(xué)院、基金委等資助。
圖1.不同培養(yǎng)條件下猴胚胎干細(xì)胞中SOX2，NANOG和KLF17的免疫熒光
圖2.不同細(xì)胞注射的嵌合胚胎體外延遲培養(yǎng)效果圖
圖3. 非人靈長類胚胎干細(xì)胞嵌合體研究模式圖
圖4. 胚胎干細(xì)胞嵌合體猴卡通寓意圖被選為該期Cell雜志的封面
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